脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNP）与脂质体（Liposomes）是当代核酸类药物递送技术体系中的核心平台。尽管反义寡脱氧核苷酸（ODN）、质粒 DNA（pDNA）、siRNA 与 mRNA 等核酸药物已在实验与临床中展现出显著潜力，但其体内递送仍依赖高效且安全的载体系统。然而，传统方法在脂质体封装聚阴离子核酸时面临 封装效率低、颗粒稳定性不足、循环寿命短以及阳离子脂质相关毒性偏高 等难题。
在此背景下，对阳离子脂质的结构调控、可离子化脂质的配方策略、多溶剂体系构建以及PEG-脂质的稳定性作用的深入探索成为推动核酸递送技术发展的关键方向。基于这一研究基础，中新康明构建了以DOTAP为核心的专用新型配方体系，旨在提升ODN和pDNA等核酸分子的封装效率与体内药代动力学表现，并形成可应用于工业化的CDMO工艺平台。
一、新型DOTAP配方体系的理论基础与工艺策略
传统使用阳离子脂质封装ODN或pDNA的方法，通常依赖电荷复合形成脂质复合物。然而此类复合物往往具有结构松散、颗粒不均一、易聚集以及体内毒性偏高等缺陷，难以满足临床需求。相比之下，近年来 DODAP 等可离子化脂质的发展为核酸封装工艺的优化提供了显著启发。
中新康明在此基础上，结合DOTAP的结构优势与电荷特性，形成如下关键技术路线：
1. 乙醇参与的缓冲体系构建
通过引入高达 40%（v/v）乙醇含量的混合溶剂体系，打破单一水相条件下核酸–脂质结合效率受限的局面。乙醇具有以下作用：
促进DOTAP在核酸接触阶段快速组织化
降低脂质双层能量，使脂层更容易包覆核酸
改善脂质在酸性条件下的扩散与成膜行为
该方法能够实现远高于传统复合方法的核酸负载量（可达约 0.15–0.25 g ODN/g total lipid）。
2. 在酸性条件下促进DOTAP质子化
DOTAP本身为季铵盐结构，带永久正电，但实验表明在弱酸条件（pH 3–5）下其与核酸的结合动力学更为有利。新型工艺将配方构建阶段置于酸性环境，可实现：
更充分的DOTAP–核酸复合
更均一的颗粒结构
更高的封装效率（最高可达约 70%）
3. PEG-修饰脂质的加入防止颗粒聚集
PEG-脂质（如PEG-DMG、PEG-DSPE）在配方中具有双重作用：
抑制DOTAP与核酸快速不均一聚集
在中性pH值下提供稳定的空间位阻，提升体内循环寿命
4. 构建SALP（Stable Antisense Lipid Particles）类结构
中新康明通过冷冻电镜与31P NMR证实：
DOTAP新型工艺形成的颗粒呈 单层与小多层囊泡的混合群体
粒径集中在80–140 nm
构型与经典SALP体系高度相似
这证明DOTAP在该工艺下具备构建高稳定性核酸颗粒的能力。
二、结构与功能表征：全面评估DOTAP新型工艺的可行性
中新康明建立了系统性的检测与验证体系，以支持DOTAP工艺优化及量产需求。主要包括：
1. 封装效率的定量评估
基于多种核酸检测方法：
RiboGreen / PicoGreen / OliGreen
核酸酶保护实验
原位酶解分析
确保封装率可稳定达到 60–70%。
2. 颗粒结构与物理特性分析
DLS测粒径与 PDI
Zeta potential测电位
Cryo-EM观察囊泡结构
31P NMR评估核酸定位状态
通过上述体系，能够精确确认颗粒结构的均一性以及核酸封装模式。
3. 稳定性研究
包括：
长期与加速稳定性
乙醇残留与pH变化监测
体外血浆稳定性
该工艺所得DOTAP颗粒可在多周至数月范围内保持稳定粒径。
4. 体内循环与药代研究支持
与游离核酸或传统DOTAP复合物相比，新型颗粒具备：
明显延长的体内循环寿命
更佳的组织分布特征
显著降低的急性毒性.
三、中新康明在DOTAP原料供应与CDMO工艺链条方面的系统能力建设
通过多年技术积累，中新康明已构建起涵盖DOTAP从原料到制剂的全流程平台。
1.DOTAP大包装原料提供能力
多级生产线，实现公斤至百公斤级批量供应
高纯度DOTAP（HPLC/NMR/LC-MS 可证）
低水分、低溶剂残留、低内毒素
支持GMP标准生产
可满足 LNP/mRNA 疫苗、反义药物、基因治疗等不同需求。
2. 工艺开发能力
涵盖：
DOTAP配方优化
PEG-脂质筛选
乙醇体系条件控制
pH梯度调控
流体混合/微流控工艺评估
可实现从毫升级到百升级的全阶段开发。
3. 中试与商业化放大
基于 T-mixing、microfluidic、ethanol injection 等工艺平台，中新康明可实现：
重复性强的批间一致性
工艺参数可控可追溯
从 GLP→GMP 的无缝切换
满足 IND 用批与商业化批次的生产要求。
4. CMC 与注册支持
包括：
分析方法开发/验证
批记录与工艺验证
稳定性研究体系建立
IND 和 NDA 申报资料撰写
DMF 提交与国际注册支持
助力客户加速实现核酸药物从研发到临床的转化。
参考文献：“Efficient encapsulation of antisense oligonucleotides in lipid vesicles using ionizable aminolipids: formation of novel small multilamellar vesicle structures”
节选：用于将反义寡脱氧核苷酸（ODN）和质粒 DNA 包装在脂质囊泡中的典型方法会导致包封效率极低，或者所使用的阳离子脂质在静脉注射时会表现出不利的药代动力学和毒性特征。在本研究中，我们描述并表征了一种新型的封装工艺，该工艺利用可离子化的氨基脂质（1，2-二油酰基-3-二甲基氨基丙烷，DODAP）和含乙醇的缓冲体系，用于将大量（0.15^0.25 克 ODN/克脂质）聚阴离子 ODN 包装在脂质囊泡中。这个过程需要含有高达 40%的乙醇（体积比）以及初始配方在酸性 pH 值条件下进行，此时 DODAP 带有正电荷。此外，在配方过程中还需要添加聚乙二醇 - 脂质以防止聚集。所形成的“稳定反义脂质颗粒”（SALP）在调整外部 pH 至中性 pH 值时保持稳定，且该配方的封装效率最高可达 70%。通过核酶保护试验和 P NMR 测量证实了 ODN 的封装。冷冻电子显微镜显示，最终的颗粒由单层和小多层脂质囊泡（直径 80 - 140 纳米）组成，其相对比例取决于初始的 ODN 与脂质的比例。最后，SALP 在小鼠体内的循环寿命明显优于游离反义 ODN、阳离子脂质/ODN 复合物以及使用四价胺脂质制备的 SALP。考虑到这种配方的微小颗粒尺寸、改进的封装效率以及循环时间，它显示出显著的优越性。与其他人相比，我们认为 SALP 在涉及核酸的系统性应用方面具有可行性。
四、结语：基于DOTAP的递送体系将成为核酸治疗的重要组成
基于DOTAP的新型配方工艺不仅在封装效率、稳定性与体内药代动力学方面实现显著提升，其制备工艺也具备高度可控性和可扩展性，使其成为 nucleic acid therapeutics 领域的重要载体选择。
中新康明将持续深化DOTAP、DODAP、DODMA 等阳离子与可离子化脂质的材料研究，并通过稳定的原料供应体系、专业的配方工艺开发平台以及成熟的CDMO体系，为全球核酸药物研发团队提供强有力的技术与产业化支持。
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